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Werstern blot样本制备过程

发布时间:2021-06-29

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蛋白免疫印迹即Werstern blot ,是将印迹技术与抗原抗体反应的特异性相结合的检测技术,用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。 其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后,通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质(NC膜或PVDF膜)上,将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上,利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物,从而显示出待测蛋白的存在及量。

样本制备:

1、样本的来源:细胞培养上清;细胞(胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白) ;组织匀浆 

2、不同样本有不同的提取方式:蛋白完全裂解液、RIPA、 胞核/胞浆

3、蛋白的提取: (裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM )

4、蛋白定量: BCA检测法(灵敏度高,操作简单,常用)、Bradford 检测法、Lowry 检测法、UV测量、电泳检测

5、样本上样前的处理:蛋白提取液和SDS上样缓冲液( Loading buffer )以一定的比例上样

6、蛋白变性: 95-100°C变性5分钟(为了能使抗体接触到抗原表位,必须将蛋白的三维结构打开,因此需要将蛋白变性,核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数,煮样时间延长至10-15min)

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